چکیده

 رنگ گل یکی از مهمترین فاکتورهای موثر در بازاریابی گلهای شاخه بریده وگیاهان زینتی می باشد.گلهای دارای رنگ بنفش، آبی و بنفش مایل به ارغوانی در بعضی از گیاهان زینتی از جمله: رز، میخک، داوودی وژربرا که به صورت عمده کشت می گردند وجود ندارد. ایجاد الگوهای جدید رنگ در گیاهان زینتی همیشه جنبه اصلی طبقه بندی اصلاح آنها را تشکیل می دهد که با آنالیز بیوشیمیایی و شیمیایی اجزاء مسئول تشکیل رنگ همراه است. اجزاء شیمیایی که روی تشکیل رنگ در گیاهان زینتی مؤثر هستند عبارتند از: کارتنوئیدها، بتالاین ها، فلاونول ها، چالکون ها، آئرون ها و آنتوسیانین ها. چندین نوع از آنتوسیانین ها همراه با سایر فلاونوئیدها در واکوئل های سلول اپیدرمی واقع شده اند. ژنهای مسؤل تولید آنتوسیانین به چهار گروه طبقه بندی می شوند: گروه اول: ژنهای مسؤل تولید آنتوسیانین و فلاونول، گروه دوم: ژنهای مسؤل هیدروکسی لاسیون و متیلاسیون مولکول های آنتوسیانین، گروه سوم: ژنهای کنترل کننده گلیکوسیلاسیون و آسیلاسیون مولکولهای آنتوسیانین، گروه چهارم: ژنهایی که رنگ را درقسمتهای مختلف گل بدون تغییر ترکیب شیمیایی مولکول آنتوسیانین تغییر می دهند. به دلیل اینکه تمام اجزاء با همدیگر رنگ نهایی گل را تعیین می کنند کار اصلاح گران کلاسیک برای طراحی یک واریته ویژه بسیار پیچیده می شود. به عبارت دیگر در بین افراد لاینها تنها بعضی از اعضاء ذخیره ژنی، ژنهای رنگ گل را نشان می دهند که به این معنی است که رنگ در یک گیاه نمی تواند در گیاه دیگری که فاقد ژنهای مقتضی است تولید شود. علاوه براین محدود بودن ذخیره ژنی (کنترل کننده رنگهای بخصوص) موجود در افراد گونه ها ایراد دیگر بر اصلاح کلاسیک می باشد.همچنین PH درون واکوئل سلول در تعیین رنگ نهایی گل موثر است. بیولوژی مولکولی با ایزوله ژن مورد نظر از یک منبع خارجی بدون هیچ گونه محدودیت و انتقال آن به درون واریته موجود این امکان را ایجاد می نماید که بر موانع غلبه نموده و واریته هایی با رنگ جدید تولید شود. این مقاله بر روی مسیر بیوشیمیایی تولید آنتوسیانین و سایر اجزاء فلاونوئیدها (مسیر فنیل پروپانوئید phenylpropanoid pathway  ) و اینکه امکان تولید واریته های بنفش و آبی در رز وجود دارد یا ندارد. همچنین نحوه ایزوله وانتقال ژنهای رنگدانه بندی به گیاهان زینتی تاکید دارد.

 کلمات کلیدی: رنگ گل، ژن، مسیر، آنتوسیانین، آنزیم، تلاقی،

 مقدمه

جدا از ایجاد ارقام جدید برای افزایش تولید مواد غذایی اصلاح گران گیاه همیشه علاقه مند هستند که طیف وسیعی از واریته های مختلف گیاهان زینتی را تولید نمایند. برای مثال صنعت گل هلند 60 درصد صادرات جهانی گلهای شاخه بریده و 50 درصد گیاهان گلدانی دنیا را به عهده دارد(Mol ) . رزها ومیخک وداوودی نمایانگر تقریبا نیمی از گلهای شاخه بریده اند که اکثر گونه های آنها بازار گل را به خود اختصاص داده اند. ایجاد الگوهای جدید رنگ در گیاهان زینتی همیشه جنبه اصلی طبقه بندی اصلاح آنها را تشکیل می دهد که با آنالیز بیوشیمیایی و شیمیایی اجزاء مسئول تشکیل رنگ همراه است(Akavia). اطلسی یکی از موضوعات اصلی این بررسیها میباشد.  امروزه 32 ژن در اطلسی شناسایی گردیده که اثر روی رنگدانه بندی گل دارد. اجزاء شیمیایی که روی تشکیل رنگ در گیاهان زینتی موثر هستند عبارتند از: کارتنوئیدها، بتالاین ها، فلاونول ها، چالکونها، آئرون ها و بویژه آنتوسیانین ها. عموماً چندین نوع از آنتوسیانین ها در واکوئل های سلول اپیدرمی همراه با سایر فلاونوئیدها واقع شده اند.

ژنهای مسول تولید آنتوسیانین را می توان به چهار گروه طبقه بندی نمود: ( Cornu)

1-    ژنهای مسئول تولید آنتوسیانین و فلاونول

2-    ژنهای مسئول هیدروکسی لاسیون و متیلاسیون مولکولهای آنتوسیانین

3-    ژنهای کنترل کننده گلیکوسیلاسیون و آسیلاسیون مولکولهای آنتوسیانین

4-    ژنهایی که رنگ را درقسمت های مختلف گل بدون تغییر ترکیب شیمیایی مولکول آنتوسیانین تغییر می دهند.

به دلیل اینکه تمام اجزاء با همدیگر رنگ نهایی گل را تعیین می کنند، به همین خاطر کار اصلاحگران کلاسیک را برای طراحی یک واریته ویژه بسیار پیچیده می کند. اصلاحگران را مجبور به ایجاد و انتخاب تصادفی فنوتیپی رنگ های موجود ودر دسترس نموده و سپس به صورت رویشی آنها را برای نگهداری تکثیر نمایند.

هرچند افزایش دانش ژنهای موجود سهم بسیار زیادی را برای اصلاح کنترل شده واریته های گل ایجاد می نمایند. اما مشکل بزرگتر دیگری در راه اصلاح کلاسیک اینست که ذخیره ژنی موجود در افراد گونه ها نسبتاً محدود می باشد. 

در بین افراد گونه ها تنها بعضی از اعضاء ژنهای رنگ گل را نشان می دهند که به این معنی است که رنگ موجود در یک گیاه نمی تواند در گیاه دیگری که فاقد ژنهای مقتضی است تولید شود.

اگر چه اصلاحگران بطور موفقیت آمیزی واریته های جدید را با هیبریداسیون بین گونه ای یا موتاسیون تولید می نمایند. این روشها همیشه با قابلیت تلاقی پذیری لاین های مختلف محدود می شوند. بیولوژی مولکولی امکانی را ایجاد می نماید تا با استفاده از ایزوله ژن ویژه از یک لاین و انتقال ژن به درون لاین دیگر بر موانع غلبه نمود و واریته های با رنگ جدید تولید شود.

بایستی تأکید شود که فهم جزئیات عمل و اثر متقابل ژنهای انفرادی، یک پیش نیاز ضروری برای ایجاد ابزار قدرتمند مهندسی ژنتیک در ایجاد لاینهایی با رنگ جدید می باشد.

 

مسیر فنیل پروپانوئید:

آنتوسیانین و دیگر اجزاء فلاونوئید از طریق مسیر فنیل پروپانوئید تولید می شوند. مسیر کلی فنیل پروپانوئید (Hahlbruck 1988) نه تنها ما را به تولید فلاونوئید راهنمایی می کند بلکه پیش ماده های چندین جزء فنولیک دیگر در گیاهان عالی از قبیل کومارین ها، استرهای  قابل حل، لیگنین، سوبرین و دیگر اجزاء و موارد سلولی را  نشان می دهد.

از بین گونه هایی که مسیر بیوسنتز فلاونوئید آنها بطور ژنتیکی و بیوشیمیایی به خوبی شرح داده شده ذرت و اطلسی می باشد (1984 Wiering ، 1982 Doorer).

پیش ماده اصلی فلاونوئیدها، فنیل آلانین می باشد که توسط آنزیم فنیل آلانین آمونیالیز (PAL) به 4- کومارویل (CoA) تبدیل می شود و سپس به 4- هیدروکسی لاز سینامیک (C4H) و 4- کومارات CoA لیگاز (4CL) (شکل 1).

چالکون سنتاز (CHS)، آنزیم کلیدی بیوسنتز فلاونوئید، 4- کوماریل CoA را با سه واحد از مالونیل COA ترکیب می کند تا 4،´2،´4،´6 تتراهیدروکسی چالکون که بعداً به فلاونون نارینگن تبدیل شود (توسط ایزوله از چالکون CHI) تشکیل شود.

Noringenin توسط فلاونون 3- هیدروکسی لاز (FHT) به دی هیدروکائمپفرون (Dihydrokaempfera) تبدیل می شود.

هیدروکسی لاسیون حلقه B توسط فلاونوئیدهپ 3- هیدروکسی لاز و نیز توسط فلاونوئید ´3 ، ´5- هیدروکسی لاز به دو تا دی هیدرو فلاونول ها به نامهای دی هیدروکوئرستین و دی هیدرومیریستین تبدیل می شود.

این دی هیدرو فلاونول ها می تواند به فلاونول ها و آنتوسیانین ها تبدیل شود. تولید فلاونول ها توسط آنزیم فلاونول سنتاز (FLS) کاتالیز می شود در حالیکه دی هیدرو فلاونول 4- رد کتاز (DFR) اولین آنزیمی است که در آبشار پله پله سنتزآنتوسیانین شرکت می نماید.

گروههای مختلف هیدروکسیل حلقه B و مشخصات آنها عموتاً مسئول طیف پایداری رنگ آمیزی می باشند.

دی هیدرو کامپفرول طی فرایندی به رنگدانه های پلار گونیدین منجر می شودکه نمایانگر رنگ پرتقالی یا قرمز آجری می باشد.

دی هیدرو کوئر ستین به مشتقات سیانیدین تبدیل شده که در ایجاد رنگ قرمز موثر می باشد. و دی هیدرومیریستین به مشتقات دلفیندین تبدیل می شود که آبی یا ارغوانی هستند. چندین اثرات دیگر ذکر شده در بالا اضافه می شود تا ظهور نهایی رنگ اما سه شاخه اساسی پلارگوندین، سیاندین و دلفینیدین تعیین می کند طیف رنگهایی که در گیاه ویژه ای تولید می شود.

تثبیت و تغییر مولکولهای آنتوسیانین سبب تأثیر در روی رنگ نهایی گل می شود.

در اطلسی برای شان، ترانسفراز گلوکوسیل شرح داده شده است که روی 3 مکان آنتوسیانین موثر است (Kho، 1978) و ترانسفراز دامنوسیل عمل دامنوسیلاسیون گلکوز را انجام می دهد (Kamsteeoy، 1979).

درامنوسیل یک یک آسیلاسیون با اسید 4- کوماریک باقی می ماند که عمل آسیل ترانفراز را انجام می دهد (Jonsson، 1984) آنزیمهای متیل ترانسفراز عمل متیلاسیون در موقعیت ´5 و ´3 حلقه B را انجام می دهد.

تعدادی ژنهای ساختمانی آنزیم هایی را برای بیوسنتز فلاونوئیدها کد می کنند که از چندین گونه کلون شده اند. چالکون سنتاز از Letroselium، اطلسی، Antirrhinum و ذرت کلون شده است.ایزومراز چالکون از اطلسی و دی هیدروفلانول 4- ردکتاز کلون شده از Antrrhinum ، ذرت و اطلسی کلون شده. (Beld، 1989) و آنتوسیانین افلاونول -0-3 گلوکوسیل ترانسفراز نیز از ذرت کلون شده است.

C1 که از ذرت ایزوله شده، اولین مولکولی است که ژن تنظیم کننده مسیر آنتوسیانین را بیان می کند. (Cone و همکاران، 1986)

در افراد گونه ها حضور یا فقدان آنزیم های کلیدی مسیر فلاونوئید یا خاصیت سوبسترای این آنزیمها در گیاهان مشخص، ترکیب آنتوسیانینی موجود در گل را تعیین می نماید. برای مثال در اطلسی به ندرت مشتقات پلالگونیدین یافت می شود که این به واسطه خاصیت سوبسترای دی هیدروفلاونول 4- ردکتاز می باشد که فقط روی پیش ماده های دی هیدروکوئرستین و دی هیدرومیریستین تأثیر می گذارد به این دلیل در هیچ یک از واریته های اطلسی هیچ نوع پلارگونیدین شناخته نگردید از سویی دیگر برای مثال در رزها هیچ پیگمانها یا رنگدانه های دلفنیدین وجود ندارد که این امراحتمالاً به واسطه فقدان فلاونوئید 3´ و 5´ هیدروکسی لاز می باشد که تشکیل دی هیدرومیریستین را کاتالیر می نماید. به همین دلیل هیچ واریته آبی یا بنفش نوع دلفینیدین در بین رزها یافت نمی شود. اصلاح کلاسیک به طور جزئی به فقدان این نوع آنتوسیانین تکیه می نماید به این ترتیب واریته هایی که خیلی نزدیک به رنگ دلفنیدین یا پلارگونیدین می باشند، گزینش می شوند. هرچند این فنوتیپ ها با ترکیب آنتوسیانین های مختلف، پیگمانهای مشترک و فاکتورهای دیگر از قبیل کمپلکس های ترکیبات فلزی و  PH تعیین می شود. (De Valming 1983)

ولی به علت تکثر این فاکتورها به ندرت ممکن است که یک فنوتیپ معین در تلاقی های بعدی حفظ گردد.

 

  پیش شرطهایی برای دستکاری موفقیت آمیز رنگ گلها:

مهندسی ژنتیک امکان مسلط شدن (غلبه کردن) بر موانع گونه ها را فراهم می نماید و بنابراین اصلاحگر قادر است واریته های جدیدی را تولید نماید، که توسط برنامه های اصلاحی کلاسیک ممکن است قابل تولید نباشند. برای رسیدن به این هدف حداقل سه شرط عمده بایستی وجود داشته باشد: ژن مناسب کد کننده آنزیم ویژه مسیر آنتوسیانین بایستی از لاین مشخص ایزوله شود و فراورده ژن آن، ویژگی سوبسترا را بیان نمایند. ژنها در لاین مورد نظر بیان شود و سرانجام با بیان پایدار ژن انتقال یافته در لاین هدف تضمین شود.

الف) ایزوله ژن مناسب:

چندین ژن ذکر شده در بالا که آنزیم های مسیر فنیل پروپانوئید را سنتز می کنند با روشهای مختلف ایزوله شده اند (Bled و همکاران، 1989 ، Wienand و همکاران 1986،1988، Van Tunen ) تکنیکهای دنبال نمودن ژن با استفاده از عناصر جابجا شونده (ترانسپوزانها) مورد سنجش قرار گرفته اند که در ایزوله ژنها برای موتاسیونهایی که به آسانی قابل رتبه بندی فنوتیپی هستند. بسیار قدرتمند می باشد

برای مثال در ذرت چندین ژن ساختمانی و تنظیم کننده مسیر رنگدانه بندی آنتوسیانین با کمک تکنیک دنبال کردن ژن (Gene tagging) کلون شده است. (Ldwig و همکاران، 1989، Reddy و همکاران 1987).

به منظور ایزوله یک ژن از طریق روش دنبال نمودن ترانسپوزون، موتاسیون القا شده توسط ترانسپوزون از ژن مورد نظر بایستی قابل دسترسی باشد. و نیز سپروب برای ژن ترانسپوزون در دسترس باشد. یعنی گیاه ماده ای که حاوی عنصر جابجا شونده فعال و آلل تیپ وحشی ژن مورد نظر می باشد، با گیاه نری که حاوی موتاسیون مغلوب پایدار این ژن می باشد تلاقی داده می شود. اگر عنصر جابجا شونده بدون ژن مورد نظر وارد شود، فنوتیپ موتانت در بین گیاهان F1 ظاهر خواهد شد.

موتانت های ناپدار از کتابخانه ژنومی چنین کلونهایی ایزوله می شوند که با عنصر جا به جا شونده هیبرید نمایند و توالیهای مجاور که بعداً مورد آنالیز قرار گیرند. بیشتر ترانسپوزونها درون ژنوم گیاه تکراری هستند، چندین کلون مشابه با مکانهای هدف مختلف(different target sites ) وجود خواهد داشت که برای ژن مورد نظر مورد نیاز می باشد تا بین کلونها انتخاب شود. این کار می تواند با مقایسه لاین ناپایدار با یک ریورانتتی که عمل ژن مورد نظر را باز گرداند، انجام شود. اگر هر دو لاین ناپایدار و ریورترانت توسط توالی صحیح ترانسپوزرن جستجو شوند ، نظر به اینکه در لاین ناپایدار ژن حاوی عنصر جابجا شونده می باشد در حالیکه در ریورتانت ترانسپوزون خارج شده است، منجر به تغییر اندازه قطعه برشی خواهد شد.

روش دیگر، ورود ترانسپوزون دوم به همان لوکوس مورد نظر می باشد و غربال کردن هر دو کتابخانه از دو لاین ناپایدار مختلف برای کلونهایی که حاوی توالی ادغام شده بطور مشترک می باشد. می توان با استفاده از توالی های هدف صحیح ژن مورد نظر را از کتابخانه cDNA یا کتابخانه ژنوی گونه وحشی گیاه خارج نمود.

برای اجتناب از مسئله پیوند غیر صحیح ژنها، پروموتر اختصاصی در گیاهان متفاوت برای استفاده cDNA جهت آزمایشات انتقال ژن ها قابل توصیه است که می تواند بدرون حامل بیان گیاهی کلون شود تا ژن به درون لاین هدف وارد شود.

تکنیک های دیگری برای دنبال کردن ژن، استفاده از پروب های هترولوگوس یا ایجاد کتابخانه cDNA، متفاوت از گیاهی که ژن مورد نظر را بیان نماید و گیاه دیگری که فاقد این ژن اما به لاین اول خیلی شبیه است، می باشد.

اگر یک ژن با یکی از این روشها ایزوله شود، عمل پروتئین کد شده توسط ژن بایستی آزمون شود.

این کار می تواند بطور مستقیم با انتقال ژن بدرون لاین گیرنده انجام شود برای مثال بوسیله روش Microprojectile (Ludwig و همکاران، 1990) و یا بوسیله سنجش نسخه برداری و ترجمه درون شیشه ای به منظور آزون فعالیت آنزیمی پروتئین کد شده توسطcDNA.

ب) متمایز شدن (ویژگی یافتن) لاین گیرنده:

افراد گونه های ذکر شده در بالا نه تنها در مجموعه آنزیم های موجود در بیوسنتز فلاونوئید متفاوت نیستند بلکه در خصوصیات سوبسترای این آنزیم ها نیز تفاوتی ندارند.

به این دلیل ضروری است که مجموع آنزیمی درون لاین گیرنده آنالیز شود خصوصیات سوبسترا برای آنزیم های افراد لاین گیرنده، آنالیز رنگدانه های گیاه بطور قابل ملاحظه ای بهبود یافت با شروع اولین گزارشات استفاده شد، از کاغذ کرورها توگرافی (Kazuo، 1952) و همچنین پیشرفتهای اخیر تکنولوژی آنالیز همچنین روشن شدن مسیر کلی آنتوسیانین، تعیین الگوهای فلاونوئید همچنین سهم بزرگی برای بهبود دانش سیستماتیک گیاهی فراهم می آورد و فلاونوئیدها می تواند استفاده شود برای نشانگرهای تاکسونوبیک (Harbore، 1975)

ذخیره ژنی و تشخیص سوبسترا درون گونه های بخصوصی می تواند توسط آنالیز پیش فاکتورهایی که تجمع می یابند به واسطه توقف فعالیت آنزیمی درون افراد موتانت صورت پذیرد.

اگر یک موتانت ویژگی یابد برای داشتن پیش فاکتوری که می تواند به کار گرفته شود به عنوان یک سوبسترا برای ژن کلون شده، ورود این ژن باعث تبدیل پیش فاکتور می شود که می توانند مسیر فلاونوئید را به جهت بخصوصی جهت یابی نماید. آن بطور واضح کافی نیست برای ویژگی یابی لاین گیرنده که تنها برای تجمع سوبسترای مناسب که می توانند به کار رود به عنوان پیش فاکتور برای آنزیم کد شده توسط ژن خارجی. آن همچنین می تواند برای آزمون فراورده حاصل از فعالیت آنزیمی به کار رود به وسیله مجموعه ژن داخلی لاین گیرنده برای تولید پیگمانهای مناسب. بهترین راه برای رسیدن به هدف دوم این است که لاین گیرنده ای را فراهم کنیم با فرآورده ای را که تولید می شود از ژن فعال و آنالیز آنهایی که پیگمانها توسط لاین گیرنده تولید می شود (Forkman، 1974)

اگر فقط روشن شود که ژنی صحیح کلون شود و آن فعالیت ژن درون لاین گیرنده بخصوص به طور واقعه ای تولید خواهد کرد فراورده ای که مناسب برای مجموعه آنزیمی لاین گیرنده نمی باشد، ما می توانیم انتظار داشته باشیم که مهندسی کنترل شده مسیر آنتوسیانین موفقیت آموز خواهد بود.

ج) بیان پایدار ژن خارجی:

موفقیت ورود یک ژن ویژه به درون لاین گیرنده وابسته است به بیان پایدار ژن خارجی بویژه اگر شخصی ملاحظه نماید که چنین لاین تراریختی می تواند استفاده شود در تلاقی های بعدی برای معرفی ژن جدید به درون لاین های دیگر مورد نظر گزارشات متعددی وجود دارد برای تنوع و عدم پایداری ژنها در گیاهان ترانس ژنیک (Dean، 1988) گزارش شده است که ژن می تواند فعالیت نسخه برداری اش را از دست بدهد بعد از رسیدن به نسل بعدی یا بعد از ورود ساختار خارجی به درون چنین لاین تراریخت (Matzk، 1989) گروههای دیگری تنوع قابل ملاحظه ای را اندازه گیری نموده اند در سطوح نسخه برداری که در لاین های تراریخت تولید می شوند.

همچنین گزارش شده که عدم فعالیت بخصوص ساختار تراریخت  در بین گونه های گیرنده و در بافت های مختلف متفاوت می باشد    .(Benfey، 1989)

در سیستم های حیوانات ممکن است بیان ژن خارجی در یک وضعیت مستقل و پایدار قابل دسترسی باشد با معرفی ناحیه 5 ویژه همراه با ژن مورد نظر (Stief و همکاران 1989). در گزارش دیگری می تواند تضمین شود که ژن B گلوبین همراه با یک ژن انتقال داده شده بیان شود.

در سلولهای گیاهی تاکنون روشهای مشابه موفقیت آمیز نبوده است. در یک گزارش ما نشان دادیم که توالی ژنومی ایزوله شده از ژنوم اطلسی ممکن است پایدار بوده و وضعیت (مکان) بیان ژن خارجی مستقل باشد رقمی که به ناحیه ساختاری واحد 5 (آن ژن) وارد شود. این فرضیه از مشاهده چنین کلونهایی که فراوانی های انتقال ژن بطور شدید افزایش یافته بود ایجاد شد و اکثریت گیاهان تراریخت حاوی تنها یک کپی از ساختار انتقال یافته بود.

یک تفسیر و تعبیر از این امر اینست که ژن ساختمانی همیشه بطور فعال نسخه برداری می شود، با مستقل از ناحیه ادغام و بنابراین تعداد بزرگتری گیاهان ترانسفروم بدست می آید. تأیید این فرضیه، هرچند آنالیز بیشتری را نیاز دارد.

روش دیگری برای دستیابی به وضعیت مستقل و بیان ژن پایدار می تواند استفاده از سیستم های همانند سازی خودبخودی از قبیل حامل های جایگزین و روی باشد.

گزارشات در مورد بیان ژن ساختاری  GUS که به درون یک وکتور ویروسی (TGMV) که ژن پوششی پروتئینی آن حذف شده بود وارد شده بود نشان داد که چندین روش ممکن است مناسب و عمل باشد. اگرچه بیشتر ویروسهای گیاهی محدودیت بسیار زیادی را برای ورود NAهای بیگانه تاکنون گیاهان تراریخت مناسب که نسخه برداری پایدار از ژن انتقال یافته نشان دهند در سطر آزمایشی انتخاب شده اند.

4- انتقال ژن A1 ذرت به اطلسی:

انتقال ژن A1 ذرت Zea mays به اطلسیhybrida Petunia  اولین مورد موفقیت امیز از مهندسی رنگ گل جدید می باشد که با انتقال ژنی مورد نظر و دانش پیشرفته مسیر فلاونوئید و اطلسی را دربر دارد.

ژن A1 که دی هیدروفلاونول 4- ردکتاز را کدهی نماید اولین بار با استفاده از  دنبال نمودن ژن (sere tagging) از دو موتانت غیر پایدار مختلف ایزوله گرید. یک cDNA از ژن A1 ایزوله گردید و سپس کلون گردید به درون یک وکتور حامل بیان ژن، با استفاده از بیان پروتئین درون شیشه ای (Invitro) ژن نشان داده بود که ژن A1 ذرت برای دی هیدروفلاونول 4- ردکتاز کد می نماید. این آنزیم حاوی سوبسترای ویژه برای دی هیدروکوئرستین و دی هیدروکائمپفرول که سبب تشکیل رنگدانه سیانیدین و پلارگونیدین میشود (شکل 1).

بر خلاف ذرت آنزیم دی هیدروفلاونول 4- روکتاز در اطلسی دی هیدروکوئرستین و دی هیدرومیریستین رابه عنوان سوبسترا استفاده می کند نه دی هیدروکائمپوول را. به واسطه همین حقیقت تنها مقدار کمی پلارگونیدین می تواند در اطلسی یافت شود. هدف آزمایش، انتقال ژن A1 ذرت به لاین ویژه ای از اطلسی به نام (RL01) بود که دی هیدروکائمپفرول را تجمع نماید با بلوکد کردن فلاونوئید 3 هیدروکسیلاز و´3 و ´5 هیدروکسی لاز  که مورد نیاز هستند برای تشکیل دیهیدروکوئرستین و دی هیدرومریستین لاین RL01 حاوی تنها مقدار خیلی محدود شده ای F3´5´H می باشد و آن نمایش تقریباً  به دلیل خصوصیت سوبسترای ویژه آن فرآورده ژن A1 بایستی کاتلیزه نماید تبدیل دی هیدروکائمپزول را به گلیکوسیدهای پلارگونیدین در RL01.

ترانسفورماسیون لاین RL01 با استفاده مستقیم NAهای پروپلاست انجام گردید. با رکتور بیان کننده شان گیاهی حاوی cDNAی A1 ذرت اینسرت شده بین پروموتر S35  CaMV و خاتمه فوق آن از بین گیاهن ترانسفورنست باززایی شده شناسایی گردید گلهای قرمز نوع پلارگونیدین. این نوع رنگ پلاگوندیو بیان می گردد ژن A1 را و آن می تواند تأیید شود توسط تروماگرافی که پیشنهادهای اصلی در گیاهان ترانژتیک پلاگونینیدن 3- گلیکوسیددها می باشد.

به منظور آزمون پرفورمنس فنوتیپ چدید در تلاقی های ----- یک ترانسفورمات ویژه RL01-17 که بطور پایداری رنگدانه پلاگونیدین تولید مارکر مورد استفاده قرار گرفت ---- با نژاد دیگر، (Red Titan) که حاوی فعالیت فلاونوئید ´3- هیدروکسیلاز، در بین گیاهان F2­ فنوتیپ Red Titan تولید کننده گلها مشاهده گردید، همچنین فنوتیپ ترانژنیک پلارگوندین تولید کننده گلها و مخلوطهایی از رنگدانه  در این گیاهان که احتمالاً تشکیل می دهند هر دو پیش ماده هیدروکائمپفرول، ذی هیدروکوئرستین (شکل 2)

این امر اثبات می نماید که رنگدانه جدید می تواند انتقال داده شود در تشکیل فعالیت آن بدرون لاینها از طریق تلاقی برای ایجاد واریته ای با رنگ جدید.

5- آنالیز رنگارنگی (چند رنگی):

با توجه به اینکه بیان ژن A1 به آسانی می تواند با غربال یا انتخاب فنوتیپ قرمز کنترل گردد، این سیستم همچنین یک ابزار مفیدید را برای بررسی های بیان ژن فراهم می نماید. بعد ا انتقال ژن A1 ذرت به اطلسی، سه نوع گیاه تراریخت در بین گیاهان باززایی شده مشاهده گردید که هیچ رنگدانه بندی را نشان نداد بنابراین رنگدانه بندی تنها در بعضی از سلولهای گل یا رنگهای پایدار در کل گل مشاهده گردید. این سه نوع گیاه (بیان ژن) سفید، رنگارنگ و قرمز بودند (شکل 3) که مورد آنالیز قرار گرفتند.

ما جزئیان آنالیز این پدیده را توضیح می دهیم:

اولاً همبستگی غیرمستقیمی بین پایداری بیان ژن A1 و تعداد کپی ساختارهای A1 موجود در گیاهان تراریخت مشاهده گردید. 75% از گیاهان قرمز حاوی تنها یک کپی از ژن ساختاری A1 بود در  حالیکه 80% از گیاهان رنگارنگ و 80% از گیاهان تراریخت سفید حداقل 2 کپی از ژن A1 ادغام شده در ژنوم را داشتند (شکل 4).

ثانیاً همبستگی بین متیلاسیون پروموتر 35S در جایگاه Hpa? و تعداد کپی های ادغام شده مشاهده گردید. اگرچه این مکان Hpa? با ناحیه درون پروموتر 35S که مسئول تنظیم فعالیت نسخه برداریست همبستگی ندارد. آن احتمالاً واقع شده در مجاورت این ناحیه و می تواند برای نقشه یابی این ناحیه پروموتر مورد استفاده قرار گیرد که به نظر می رسد تنظیم نسخه برداری ساختار A1 را به عهده دارد.

آنالیز یک کپی ادغام شده ها بین گیاهان تراریخت آشکار نمود که 4 گیاه تراریخت که تیله نشده بودند در مکان Hpa? فنوتیپ قرمز را نشان می دهد، در حالیکه 3تاری دیگر از این گیاهان در این مکان متیله شده بودند. از این گیاه یکی از آنها قرمز، یکی رنگارنگ و یکی سفید بود. این اطلاعات نشان می دهد که تحت متیلاسیون مکان Hpa? در بیشتر موارد هماهنگ بود با پایداری فنوتیپ قرمز. برخلاف این سه نوع وقتی که گیاهان تراریخت که حاوی بیشتر از یک کپی A1 ادغام شده بودند مورد آنالیز قرار گرفتند، تنها در دو مورد مکان Hpa? متیله نشده می توانست شناسایی شود در حالیکه 9 گیاه دیگر نشان داد که این مکان متیلهشده است.

در تنها دو مورد جائیکه گیاه سفید با چندین کپی ادغام شده حاوی مکان Hpa? با پروموتر S35 بود و آن غیر واضح باقی ماند اگر این کپی پروموتر پیوستگی داشته باشد با کپی A1 دست نخورده این امر برای تشخیص مشکل است به علت تعداد کپی زیاد که ساختارهای A1 ادغاک شده اند. اطلاعات منجر به این نتیجه می شود که ژن A1 خارجی تنها در یک کپی قابل بیان است در جائیکه بیان آن ژن همبستگی دارد با عدم میتلاسیون پروموتر S35. این نتایج می تواند حداقل در دو راه مختلف شرح داده شود:

1- ادغام کپی های چندتایی پروموتر می تواند موجب کاهش فاکتورهای اتصال که ضروری هستند برای ژن می شود و متعاقباً موجب متیلاسیون ناحیه پروموتر می باشد در طی دوره چرخه زندگی گیاه متیلاسیون ناحیه پروموتر از بافت برگ نخود و تنباکو ایزوله شده است. 2 محرک TGACG درون پروموتر S35 به عنوان جایگاههای اتصال ASF-1 شناسایی شده است. به نظر می رسد که ASF-1 در بیان پروموتر S35  در ریشه گیاه موثر می باشد در حالیکه حداقل یک فاکتور دیگر بالا دست جایگاه اتصال ASF-1 احتمالاً برای فعالیت پروموتر در برگ ضروری می باشد. حدس زده می شود که اعمال ASF-1 بعنوان یک فاکتور محدود کننده بویژه در بافت برگ باشد و اتصال ASF-1 می تواند در ریشه های گیاه از پایداری به نظر مهم نمی رسد برای ASF-1.

اگر جایگاه های اتصال ASF-1 چندگانه وارد گیاه تراریخت شوند ممکن است سبب محدود شدن فعالیت ASF-1 درون سلول شود، برای مثال با اتصال به نواحی پروموتر کوتاه شده که بطور طویل به ژن A1 فعال متصل نشده است. چنین اثر تیتراسیون فاکتور می تواند به خدمت گرفته شود جهت تشریح مشاهدات خیلی مشابه که توسط دیگر گروههای تحقیقی گزارش شده اند، در جائیکه آن نشان داده است که بیان ساختار T-DNA ثانویه حذف شده بود با تلاقی های برگشتی بیان ساختار اول می تواند برگشت داشته (بازگردانده شود) که همراه است با متیلاسیون پروموترهای منطبق. در این مطالعه تمام ژنها تحت کنترل سنتاژ پروموتر در محدود کردن مقادیر کاهش یافته اتصال چندگانه در مقایسه با مدلی که ایجاد شده برای ASF-1 و S35 پروموتر در پروموتر NOS موتیف TGACG نیز وجود دارد. بعنوان توالی مکمل هگزاهر اتصال دهنده ACGTCA که بعنوان جایگاه شناسایی برای اتصال DNA HBP-1 به کار می رود و در پروموترهای گیاهان مختلف ذخیره می شود. (قرار داده شود).

2- شرح دوم برای بیان ترجیحی یک کپی ادغام شده می تواند پیش انتخاب نواحی ادغام در کرموزوم گیاه باشد که تضمین های بیان پایدار ژنهای خارجی می باشد. آن قابل تصور است که انتخاب تراریخت ها با استفاده از کانایاسین منجر به ایزوله تراریخت هایی می شود که ژن NPT? بطور فعال نسخه برداری می شود. در یک کپی ادغام شده ژن A1 همیشه نزدیک (بعد از ) ژن NPT? فعال واقع شده که آن احتمالاً سبب می شود که ژن A1 بطور فعال نسخه برداری شود اگر ناحیه ادغام  روی پایداری نسخه برداری مؤثر باشد.

در موردیکه چندین کپی نسخه) ادغام شده باشد ژن ساختاری A1 بطور ضروری نیازی به این ندارد که نزدیک ژن NPT? واقع شده باشد. این امر اثبات می نماید که انتقال مستقیم ژن از DNA پلاسمید به پروتوپلاست ها منجر به ادغام چندین نسخه (کپی) یا کمتر کوتاه شده میشود.

بنابراین ممکن است که ژن NPT? انتخاب شده بتواند پیوسته باشد با کپی (نسخه) A1 غیر کامل و چندکاره، به این علت ژن A1 فعال کنترل می کند رنگدانه بذر گل را که در لوکوس کروموزری متفاوت واقع شده است.

تحت این فرض که ژنهای ادغام شده به درون ژنوم بطور تصادفی متیله شوند و بنابراین نسخه برداری غیر قابل ژن A1 در اکثریت تراریخت ها بیان نمی شود. فراوانی چنین متیلاسیون ممکن است با ناحیه فرو رونده تعیین گردد و آن ممکن است شاید بیان ژزن فعال را نگه دارد با ورود نواحی بزرگتر ژنهای فعال. پایداری قابل ملاحظه ای ار تنوع عمومی در بیان ژن مشاهده گردید. زمانیکه ژن B-globin انسان وارد موش گردید، قرار گرفت در دو طرفه ناحیة 5، 21 کیلو بازی و ناحیه 31 ، 12 کیلو بازی در گیاهان نیز تاکنون روشهای مشابه ای موفق نشده است. وقتی که ژن SSU 301 rbcs اطلسی وارد تنباکو گردید با ناحیه 51 و 10 کیلوبازی و توالی های 3، 13 کیلو بازی احاطه گردید. هیچ کاهشی برای تنوع بیان ژن بین تراریخت های مختلف مشاهده نگردید اثر موضعی براثر ورود DNA ترانس ژن به مکانهای مختلف کروموزوم ممکن است ایجاد گردد. با تفاوتهای در ساختار ایزوکور مکان ادغام شده ژنوم هسته ای نهاندانگان با قطعات DNA هموژنوس 100 تا 200 کیلو باز ترکیب می شود که ایزوکور Isochore نامیده می شود. ایزوکورها تشخیص داده می شوند با ستون GCاش و با تفاوت هایی مشخص می شود برای الگوهای ایزوکور تک لپه ای ها و دولپه ای ها گونه های تک لپه دامنه GC بالایی از ایزوکتورهایشان نشان می دهند. و ژنهایی با GC زیاد ولقع شده اند در نواحی پر از GC در حالیکه ژنهای با GC کم با ایزوکورهای با GC کمتر مطابقت دارند. اثر شخصی درنظر بگیرد که ژن A1 از گیاه تک لپه گرفتته شده است. بیان آن ممکن است تحت تأثیر ورود به ناحیه ایزوکور یک دو لپه ای ویژه اطلسی باشد که در اکثر موارد و احتمالاً در محتویات GC آن پائین باشد به این ترتیب قابل تصور است که هر دو مکان ادغام و اثر مقابل ناحیه پروموتر با فاکتورهای ویژه سلولی دور الگویی بیان موثر هستند. پروموتر S35 یک خصوصیت ویژه ای در بیان ژن در بافت مارکل اعطا کنند که در میزبانهای تراریخت گونه های مختلف متفاوت است. بیان ژن در اطلسی در گلبرگها مشاهده گردید و تنوع در الگوی بیان ژن در گلها مشاهده گردید. در تنباکو تراریخت هرچند فعالیت در بافت آوندی گلبرگ موردشناسایی قرار گرفت و تنها گهگاهی در باف مزودرم و اپی درم موقعیت کروموزمی ممکن است در انواع سلولهای ویژه روی عناصر مشخص که بیان پروموتور S35 را تنظیم می نماید اثر متفاوتی داشته باشد. که منجر به تنوع در الگوهای بیان بین تنباکو و اطلسی می گردد. قاکتورهای اتصال که الگوی بیان سلول ویژه را تنظیم می نماید ممکن است در قرابت یا فراوانی در گیاهان مختلف و بافت ها متفاوت باشند. به منظور تصمیم گیری برای اینکه اگر یکی از این دوتا یا هر دو تفسیر قابل ارزیابی هستند. برای تشریح پدیده های مشاهده شده آنالیز  بیشتر تنوع (رنگارنگی) بایستی انجام گردد. از مکان ادغام و تلاقی های مقتضی بایستی انجام شود برای آزمون تأثیر کپی های چندگانه رویالگوهای بیان ژن.

نوع دیگری از رنگارنگی برای تراریخت هایی با کپی چندگانه ویژه مشاهده گردید. این شاخه های نمو یافته لاین رنگارنگ با گلهای کاملاً رنگی نزدیک به شاخه ها که فعالیت ژن A1 را نشان می دهد. هر دو شاخه ها بریده شدند و ریشه دار شدند برای تولید فنوتیپ های قرمز و سفید که شامل ژنوتیپ یکسان هستند. وقتی که این دو گیاه که minus و plus نامیده شوند، که تلاقی داده می شوند با یکدیگر نسبت یک به یک نتایج قرمز و سفید بین گیاهان F1 مشاهده نگردید وقتیکه گیاه plus به عنوان والد ماده در نظر گرفته شد.

بطور شگفت انگیزی، هیچ فعالیت A1 بین نسل F1 مشاهده نگردید وقتیکه گیاه plus به عنوان والد گرده دهنده تلاقی بود. همچنانکه آنالیز ساترن بلات آشکار نمود که هیچ نسخه A1  در آنجا وجود ندارد که تنها در گیاهان قرمز حضور داشت و در گیاهان سفید بدست نیامد و بنابراین این پدیده بواسطه صدمه (تلفات) نسخه A1 فعال در خلال انتقال دانه گرده نبود، ژن A1 فعال شده بطور آشکاری دوباره در خلال انتقال آن از طریق دانه گرده غیر فعال گردیدی در حالیکه آن تقریباً بطور پایداری در یک وضعیت فعال در سلول مادری نگه داشته شد. این اثر یادآور پدیده عدم انگشت نگاری ژنومی همچنانکه در حیوانات شرح داده شد می باشد جائیکه بیان متفاوت ژن در نتایج تلاقی های جنسی برای ژنوم پدری و مادری مشاهده گردید.

مشاهدات مشابهی برای فعالیت عناصر جابجا شونده صورت گرفت که وابستهت به فراوانی جهت تلاقی می باشد.

آینده نشان خواهد داد در این مورد که بیان ژن A1  نمایانگر رفتاری اپی ژنتیک ناحیه ویژه ادغام می باشد. علاوه بر این پدیده شرح داده شده رنگارنگی بین تراریخت های اولیه، اثرات محیطی همچنین بطور آشکاری منجر به عدم پایداری در بیان لاین های ترانسژن حاوی یک نسخه می شود. در گیاهان مسن تر فنوتیپ قرمز تنظیم ژن A1 در بعضی گلها مشاهده گردید. آنالیز ملکولی نشان داد که این اثر همراه است با طیفی از ناحیه متیله شده درون پروموتر S35 (شکل 5). آن مطمئناً وظیفه و کار خیلی مشکل و پیچیده خواهد بود برای تعیین فاکتورهای انفرادی که درون پایداری بیان ژن در گیاهان تراریخت مؤثر هستند. از جمله دیگر ................. به تأثیر سن، شرایط نوری، تغییرات دما یا فصل می باشد که احتمالاً روی الگو بیان که ممکن است برای نواحی ادغام متفاوت باشد.

6- ممانعت مسیر پیچیده (مداخله در مسیر کمپکس):

ورود غیر عادی ژن باکتریایی که یک کار وظیفه جدیدی در گیاه ایجاد می نماید، از قبیل مقاومت برضد آنتی بیوتیک و یا علف کش، ورود یک عضو از مسیر بیوشیمیایی پیچیده به درون گیاه ممکن است اثرات ثانویه داشته، به ویژه اگر ژن وارد شده تحت کنترل پروموتر طبیعی اش نباشد.جدا از تولید رنگدانه های فلاونوئید گل فرایندهای دیگری نیز دخیل هستند مثل واکنش به شرایط محیطی و در ارتباط با عوامل بیماریزا. مشارکت فلاونوئیدهای مشخص در محافظت برعلیه نور UV اثبات گردیده است، (Chappell، 1984) فعالیت ژنهای گروه سازی ریزونوم بعنوان فیتوآکسین ها و در القاء ناحیه بیماریزا (Vir) پلاسمید Ti آگروباکتریوم دخالت دارد.

در اطلسی ژنهای چالکون سنتاژ، ژنهای چالکون ایزومراز و ژنهای 4- ردوکتاژ درهیدروفلاونول تاکنون مشخص شده اند با مراجعه به فعالیت متفاوت شان و آنها نشان داده شده اند که در بافتهای ویژه تنظیم می شود و بطور توسعه یافته ای آنالیز نورترن بلات بافت برگ نشان داد که بیان ژن A1 با پروموتر S35 بطور واضحی منجر به فعالیت پیوسته A1 درون گیاه تراریخت می گردد. آن بایستی آنالیز گردد، اگر چنین فعالیتی منجر به تغییرات مقادیر نسبی دیگر اجزاء مسیر فنیل پروپانوئید و این می تواند منجر به اثرات ثانویه گردد. در این رابطه کمک خواهد شد برای مقایسه پروفیل بیوشیمیایی گیاهان ترریخت حاوی ژن A1 تحت کنترل پروموتر S35 با گیاهانی که حاوی ساختار یکسان ایجاد شده (مشتق شده) توسط پروموتر بافت ویژه.

7- استفاده از لاین های A1 تراریخت در مزرعه:

به منظور برآورد واقعی اثرات تانویه، از قبیل تفاوت در توانایی در پاسخ به آلودگی بیماری یا عوامل محیطی، یک کممیت زیادی از گیاهان بایستی مقایسه شوند با لاین هی غیر تراریخت ها تحت شرایط مزرعه ای. در چارچوب آزمایش مزرعه آن همچنین ممکن برای کاربرد ژن A1 ذرت معرفی شده بعنوان تله و ابزاری برای ایزوله عناصر جابجا شونده، ویژه اطلسی ممکن  است در آزمایشات تعقیب ژنها در اطلسی سهیم باشد و ایزوله ژنهای ساختاری دیگر که در مسیر رنگدانه بندی وجود دارد یا هر مسیر دیگری برای موتاسیوناهیی که در فنوتیپ قابل غربال به آسانی غربال می شدند.

8- چشم اندازهای آینده:

8-1-  مهندسی لاین های دلفنیدین (دلفینیوم) زبان در قفا:

ارزیابی ژنی مشخص که آنزیم های کلیدی بخصوص شاخه ها معینی از مسیر فلاونوئید راکد می کنند یک پیش شرط برای کوشش های بیشتر ایجاد مسیرهای جدید در لاین های دیگر می باشد. یک پروژه جالب مهندسی لاین های دلفنیدین می باشد که به منظور شروع طیفی از رنگدانه های آبی، ارغوانی در ژن گونه هایی که دلفنیدین بین ارقام بین ارقام مختلف وجود ندارد. یکی از آنزیم های کلیدی که برای حصول دلفینیدین سهیم است. فلاونوئید 3- 5- هیدروکائمپفرول و همچنین مکان 5 دی هیدروکوئرستین عمل مرکز و منجر به تولید دیهیدرومیریستین که مشتقات دلفنیدین را آماده می کند. چندین روش که ممکن است مناسب باشد برای کلون کردن این ژن، برای مثال تهیه cDNA کتابخانه ای از ارقام مرتبط با نوع سیانیدین و دلفنیدین اطلسی یا انتخاب موتاسیون غیر پایدار که حامل عنر جابجا شونده وارد شده در ژن که 4 و 5 هیدروکسی لاز راکد می کند. اگر این ژن بتواند از کلون شود و وارد دیگر گونه ها شود به یک طریقی که عمل ویژه آن تقسیم شود. آن بایستی ممکن باشد برای شروع مسیر دلفنیدین در گیاهان مورد نظر که حاوی مجموعه ژن مقتضی برای تبدیل دیهیدرومیریستن به دلفنیدین.

8-2- دستاوردهای دیگر:

جداول از ژنهای مسیر رنگدانه بندی آنتوسیانین که تحت تأثیر pH راکئول در گل می باشد همچنین روی رنگ گل مؤثر است، برای مثال 4 ژن شرح داده شده اند که یه اثر غیر مفیدی روی رنگ گل دارند. برای ژنوتیپ این 4 ژن همبستگی قوی می تواند نشان دهد بین رنگ گل و pH ..... گل. روش دیگر تئوریکی ژنهای مشتمل در کم رنگ شدن یا محو شدن رنگ گل می باشد و نیز انتقال ژن از ژنهای تنظیم کننده که ژنهای ساختاری مسیر رنگدانه بندی را کنترل می کند. در ذرت، حداقل 7 لوکوس تنظیم کننده بطور ژنتیکی نقشه یابی شده اند که بیوسنتز آنتوسیانین را در بافت های مختلف تنظیم کننده نسخه برداری اثبات شده است. اگر عنصر تنظیم کننده بتواند تغییر یابد و در بافتهای معین بیان شود این کار باز داشتن ژنهای ساختاری ساختاری مسیر فلاونوئید مؤثر بود و منجر به الگوهای رنگدانه بندی جدیدی خواهد شد.

9- نتیجه:

اگر چه چندین روش دیگریمورد نیاز می باشد تا جزئیات مکانیسم های پایدار قابل درک باشد برای تنظیم بیان رنگ گل و واریته های مختلف، بویژه در آنهایی که بصورت تجاری مورد توجه هستند، از قبیل: رز، میخک یا داوودی. مشکل دیگر محدودیت در سیستم های انتقال ژن مورد نظر برای تعدادی لاین ها می باشد و یا به علت محدودیتهای طبیعی مهم اگر باکتریوم و یا پرفورمن ضعیف تعدادی گونه های مهم اگر باز زایی گیاهان بارور بعد از دست کاری ژن در کشت باتف مورد نیاز باشد. سرانجام پدیده های مشترک بیان ناپایدار و رنگارنگی نیازمند فهم جزئیات مکانیسم های ملکولی ست. آن بسیار مهم خواهد بود برای تمایز و کنترل عواملی که بیان پایدار ژن وارد شده را تضمین می نماید به منظور انجام مهندسی ژنتیک ابزار مفیدی برای اصلاح گل می باشد.

رز یکی از عمومی ترین ومهمترین گل های جهان می باشد. هر چند با وجود کوششهای انجام شده توسط اصلاح گران رز، رنگ های بسیار زیادی به استثناء رنگ آبی تولید گردیده است. رنگ گلها به واسطه قابلیت آنها برای بیوسنتز رنگدانه ها می باشد. به طور کلی دو نوع رنگدانه اصلی وجود دارد:

 فلاونوئید ها-باعث ایجاد دامنه ای از رنگ های زرد تا قرمز و آبی. این مولکولهای فلاونوئید آنتوسیانین هایی هستند که مشتقات گلیکو سیلیت شده از سیانیدین(منجربه رنگ قرمز)، پلارگونیدین (منجر به رنگ قرمز آجری)، دلفینیدین (منجر به رنگ آبی)، پتونیدین و مالویدین. این رنگدانه ها در واکوئل سلول واقع شده اند.

کارتنوئیدها- عموما رنگدانه ای برای گلهای زرد تا نارنجی.

رنگ گل همچنین تحت تأثیر هم رنگدانه ها (رنگدانه ها با هم) همراه با فلاونوئیدهای بی رنگ، کمپکس های فلزی، گلیکوسیلاسیون، آسیلاسیون، متیلاسیون، pH واکوئلی می باشد. مسیر بوسنتری رنگدانه های فلاونوئید به خوبی شناخته شده است. فلاونوئید 3 و 5و هیدروکسی لاز یکی از آنتریم های کلیدی موجود در این مسیر می باشد. متأسفانه گل رز فاقد این انزیم کلیدی است و قادر به سنتز رنگدانه اصلی آبی و لفینیدین نمی باشد.

این مثال از روشهای اصلاح کلاسیک می باشد که محدود می شود توسط کمبود (نبود) ذخیره ژن گونه های مخصوص آن دلیل طبیعی کمبود برای داشتن تک گونه هایی است که ارائه دهنده طیف وسیع واریته های رنگی می باشد.

فاکتور مهم دیگری که بایستی فراموش نکنیم این است که: دلفینیدین درواکوئل سلولهای اسپدرما گلبرگ واقع شده در pH قلیای آنکاتین 7-6. اما pH واکوئلی رز عمر آبی 5/4 تا 5/5 می باشد.

ژن رنگ آبی:

برای ایجاد توسعه واریته های آبی گونه های مهم شاخه بریده همانند رز، داوودی، میخک و ژربرا با استفاده از بیوتکنولوژی جدیدیک ناحیه تحقیقی فعال در صنعت گل می باشد. آنها این ژنها را که منجر به بیوسنتز رنگدانه آبی در گلها می شود را ژنهای آبی می نامند.

برای چیره شدن بر محدودیت ذخیره ژن و ایجاد رنگ آبی واقعی رز، یک راه حل نسبی اینست که ایزوله کنیم ژنی آبی را از دیگر گلهای آبی زیبا و ژن را درون رز قرار دهیم تا به بیوسنتز رنگدانه آبی کمک نماید. بطور امید بخشی این استراتژی جدید ایجاد رز آبی را از رویا به واقعیت تبدیل می نماید.

ژنهای فلاونئید 3- 5 هیدروکسی لاز شناسایی شده اند از مقداری گیاه دانشمندان از اطلسی به رز انتقال دهیم به مهندسی ژنتیک تسهیلاتی را برای انتقال ژن به گیاهان فراهم می نمایند.

برای ورود ژن خارجی به گیاه دو نوع روش انتقال وجود دارد:

الف: با واسطه آ گرو باکتریوم:

باکتریای Agrobacterium tumefaciens ، A. rhizogenes خاکزاد و بیماریزای گیاه هستند. این باکتریای خاک، گیاه را آلوده می کنند و چنیدین ژن آن را انتقال می دهند به سلولهای گیاهی آلوده شده، متعاقباً سلول گیاهی به میزان زیادی تقسیم می شوند و تشکیل گال را می دهند. این یک سیستم انتقال دهنده طبیعی است که دانشمندان مورد بهره برداری قرار می گیرد. که دانشمندان (آگرو باکتریوم) توسط  با حذف ژنهای تومورزا غیر مسلح نموده و آنها را مهندسی کردند. این آگروباکتریوم بطور وسیعی باوکتورهای ایمن برای انتقال ژن گیاهی مورد استفاده قرار می گیرد.

ب: جذب DNA برهند ]فاقد پوشش): شامل الکتروپوریشن، PEG و تفنگ ذره ای.

ژن آبی اطلسی کلون گردید ودر درون حامل پلاسمیدقرار داده شد. سپس وارد اگروباکتریوم گردید. (کشت همزمان) نژاد آگروباکتریوم حامل ژن آبی همراه با ریزنمونه رز انجام شد تا ژن آبی به درون ژنوم رز راه یابد. ریز نمونه های باز زایی شده در حضور مارکرهای قابل انتخاب (ژن مارکر که می تواند آنتی بیوتیک یا مقاومت به علف کشی باشد که همراه با ژن آبی انتقال یافته است) کشت شدند. سلولهای ترار ریخت، شاخه ها و شاخه های ریشه دار شده انتخاب گردیدند.

رز تراریخت جهت بیان ژن آبی جدید غربال گردید.

نتاج رز تراریخت رشد نمودند وراثت ژن آبی معرفی شده تعیین گردید.

 

رز آبی تراریخت:

دانشمندان در (Calgene Pacrfic) Florigene روی توسعه رز آبی تراریخت برای چندین سال کار می کنند. آنها ژن فلاونوئید 3- 5 هیدروکسی لاز را از اطلسی به هیبرید چای رز (Hybrida Rosa) انتقال دادند تا رز را برای سنتز دلفینیدین یاری نمایند.

ژن مارکر قابل انتخاب آنتی بیوتیک کانامایسین یا مقاومت به علف کش کلرسولفورون همراه با ژن آبی انتقال داده شد.

کمیته مشاورت دستکاری ژنتیکی (GMAC) در استرالیا آزاد سازی تقریباً 1200 رز آبی تراریخت از فلوریژن را اعلام نمود. تاریخ مورد انتظار آزاد سازی تابستان 95-94 تا انتهای 1997 می باشد. آزمایش گلخانه ای با هدف آزمون رشد و تولید رزهای تراریخت تحت شرایط تولید گل رز تجاری انجام گردید. بعضی گیاهان تراریخت همچنین بعنوان منبع گرده برای باروری گیاهان غیر تراریخت در کوشش برای انتقال ژن آبی به دیگر ارقام مورد استفاده قرار خواهد گرفت.

برای ایجاد گونه های پایدار رزهای آبی حقیقی زمان طولانی مدت مورد نیاز خواهد بود هرچند تکنولوژی مهندسی ژنتیک ممکن است یک خیابان جدیدی با اضافه نمودن یک میلیون رز آبی زیبا به درون باغ های ما در قرن آینده باز نماید.

 

منابع:

1-     Shirley B. W..،1998. Flavonoids in Seeds and grains: Physiological Function، Agronomic importance and Genetics of Biosynthesis. Seed Science Research. 8: 415-422.

2-     Forkmann G.، J. Dedio، J. Henkel، B. Min، M. Wasswnegger. 1997. Genetics، Biosynthesis and molecular Biology of Flower Colour of Dianthus Caryophyllus (Carnation). www.actahort.org/

3-     Deroles S.، M. Bradley، K. Davies، K. Schwinn، D. Manson. 1997. Generation of Novel Patterns in Lisianthus Flowers Using AN Antisense Chalcone Synthase Gene. www.actahort.org/

4-     Napier. R.. 2001. Camations with Genetically Modified Flower Colour. www.actahort.org/. Experts Group on Gene Technology.

5-     Jorgenesen R.، J. Mol. 1991. Modulation of Flower Colour and its Intensity via Directed Gene Manipulation. Genetics and Breeding of Ornamental Species. 309-316.

6-     Meyer P.. 1991. Engineering of Novel Flower Colours. Genetics and Breeding of Ornamental Species. 285-307.

7-       Reddy A.، L. British، F Salamini، H Seadler، W Rohde 1987. The A1 (Anthocyanin -1) Locus in zea mays encodes dihydroquercetin reductase. Plant Sci 52: 7-12.

8-       Reif HJ. U Niesbach، B Deumling، H Saedler 1985. Cloning and analysis of two genes for chalcone synthase from petunia hybrida. Mol Gen Genet 199: 208-215.

9-       Zerback R، K Dressler، D Hess 1989. Flavonoid  compounds from pollen and stigma of Petunia hybrida: Inducers of the vir region of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid. Plant Science 62: 83-91.

10-    Cornu. A.،D. Maizonnier.1983.The genetics of Petunia.Plant Breed Rev 1:11-58.

11-Mol. J.، A.Stuitje. A.Van der Krol.1989.Saying it with genes:Molecular flower breeding.Plant Breed. 7:148-153.

 

 

 

Mechanisms of Creating Colour and Engineering of Novel Flower Colours in Cut Flowers

 

Behrouz Moradi Ashour and Behzad Edrisi

Mahallat Ornamental Plants Research National Center

 

Abstract

The creation of new colour patterns in ornamentals has always been a major aspect of classifical flower breeding which has been accompanied  by a detailed chemical and biochemical analysis of the components responsible for colour formation. The chemical components which influence colour formation in ornamentals are carenoids، betalains، flavonols، chalcones، aurones and، specially، anthocyanins. Normally، several types of anthocyaresponsible for anthocyanin production can be classified into four groups. The first group، genes responsible for anthocyanin and flavonol production. The second group، genes for hydroxylation and mnins are located in the epidermal cell vacuoles together with other flavonoids. The genes ethylation of the anthocyanin molecules. The third group، genes leading to glycosylation and acylation of the anthocyanin molecules. The fourth group، genes which modify the colouration in different parts of the flower without changing the chemical composition of the anthocyanin molecule. As all the component together decide on the final colouration of the flower، it has been extremely complicated for classical breeders to design a particular variety in a controlled way. On the other hand، among individual lines only some members of the gene pool of flower colour genes is represented which means that a colour which is found in one plant can not be produced in another plant which lacks the appropriate genes.In addition limit potantial gene pool in plants(genes of controlling special colour). As molecular biology has made it possible to overcome the barriers of species، new colour varieties can be produced by isolating a particular gene from one line and transferring it into another line. This paper is emphasised on the biochemical pathway of anthocyanin production and other flavonoids components (phenylpropanoid pathway) and wether there is possibility producing violet and blue varieties and also type of isolation and transferring pigmentation genes into ornamental plants.